Appartenente ad una distinta famiglia padovana, durante la persecuzione di Diocleziano, arrestata per la fede, fu condotta in tribunale. Non riuscendo a farla apostatare, il giudice la condannò alla pena capitale, eseguita il 7 ottobre del 304. Il corpo della martire fu sepolto fuori del pomerio, ad oriente della città, nei pressi del teatro romano, dove poi verrà costruita una basilica. La diffusione della congregazione benedettina di Santa Giustina, che elesse la martire come sua patrona, insieme con San Benedetto, contribuì a propagare il suo culto in Italia e in Europa. Anche Venezia la elesse a patrona di tutti i suoi domini, dopo la vittoria di Lepanto, riportata nel giorno festivo della santa, nel 1571. I benedettini di Padova fondarono in suo onore la Congregazione di Santa Giustina.
Per il calendario diocesano la data della celebrazione era il 5 ottobre (il 7 ottobre per il calendario benedettino). La Congregazione per il Culto Divino, in data 22.11.206 ha riconosciuto  la celebrazione della memoria liturgica di Santa Giustina il 7 ottobre per la diocesi di Padova.
Il Comune di Santa Giustina in Colle ha provveduto a rideterminare nel giorno 7 ottobre la festività del Santo Patrono, ai fini civilistici, con decorrenza dall'anno 2011 (deliberazione della Giunta Comunale n. 61 del 18.10.2010).